製品選択ガイド（Q&A）

どのDNA Polymeraseを使えば良いですか？

標準的なPCR には ThermoPrime Taq DNA Polymerase をおすすめします。Long PCR やエラー率の低いPCR を行う 場合は、2 つの酵素を組み合わせた Extensor Hi-Fidelity PCR Enzyme をおすすめします。また、GC リッチな配列を 含む場合やDNA テンプレートへの特異性を高めたい場合には、高温活性化型のThermo-Start Taq DNA Polymerase をおすすめします。

Thermo-Prime Taq DNA Polymerase 用の添付バッファーの特長は
何ですか？

ThermoPrime Taq DNA Polymerase にはアンモニウムイオンをベースとしたBuffer IV を添付しています。Buffer IV を用いることによってPCR 産物の収量が高くなります。また、KCl をベースとしたBuffer I や Buffer II もご利用いた だけます（I とII の違いは MgCl2 の有無）。KCl バッファーにはPCR の特異性を高める作用があります。

Thermo-Start Taq DNA Polymeraseは化学修飾ですか、抗体添加タイプですか？

Thermo-Start Taq DNA Polymerase は95℃ で15 分加熱することで活性型になる化学修飾タイプのDNA Polymerase です。一般的に抗体タイプのホットスタートTaq DNA Polymerase は60℃で酵素活性が現れますが、60℃付近ではプライマーの非特異的なアニーリングが完全に解消されず、またプライマーダイマーの存在も無視できません。一方、化学修飾タイプのTaq DNA Polymerase は95℃で活性化されるため、より特異性の高い増幅が得られます。

GCリッチの鋳型DNAから増幅したい場合にはどの酵素を使えば良いですか？

Thermo-Start Taq DNA Polymerase には、GC リッチなDNA テンプレートを特異性と収量を高めて増幅するための High Performance Buffer をラインナップしています。長くて増幅が難しいPCR には、Extensor Hi-Fidelity PCR と Buffer 2 の組み合わせをおすすめします。

Extensor Hi-FidelityではどのくらいのサイズのDNAを増やすことができますか?

Extensor Hi-Fidelity PCR Enzyme は最大で 20 kb までのDNA を増幅することができます。添付のBuffer 1は12kbまでの増幅に使用し、Buffer 2は12kb以上の断片を増やす場合にご使用ください。

PCR産物をプラスミドへサブクローニングしたい場合、TAクローニングができますか？

いずれのpolymerase もターミナルトランスフェラーゼ活性（3' 末端付加活性）を持っているのでTA クローニングが 可能です。Extensor Hi-Fidelity Enzyme mix には 3' → 5' のエキソヌクレアーゼ活性（校正活性）をもつ酵素が含まれ ていますが、PCR 産物の大部分はTaq DNA Polymerase により3' 末端にアデニンが付加された状態のため、そのまま TA クローニングに使用できます（Taq DNA Polymerase 単独で反応した場合と比べると若干効率は落ちます）。サブク ローニングの際にはPCR 産物を一度精製して、このエキソヌクレアーゼ活性を完全に失活させてください（フェノー ル抽出によって酵素を完全に失活させることをおすすめします）

ReddyMixはPCR後の実験に影響しませんか？

ReddyMix に含まれているLoading Dye は制限酵素消化やサブクローニングなどの実験には影響しません。ただし DNA シーケンシング実験ではDye を除去してください。

1.1Xまたは2X マスターミックスのどちらを使えば良いでしょうか？

ご使用されるDNA テンプレートやプライマーの濃度によって使い分けてください。いずれのPCR Master Mix でも最 終的なPCR 溶液（酵素、ヌクレオチド、バッファー）の組成は同じになるように調製します。 1.1X PCR Master Mix は 45 μl のPCR Master Mix に1 μl ずつのプライマーと3 μl のDNA テンプレートを混ぜて最終的に50 μl にしてくだ さい。2X PCR Master Mix では25 μl のPCR Master Mix にDNA テンプレートとプライマーを加えた後、最終的に 50 μl になるように分子生物学グレードの水でメスアップしてください。