定量PCRキット

定量PCRはさまざまな遺伝子解析で最も高感度に解析できる実験手法で、今日アカデミアや遺伝子診断の研究分野で一般的に用いられている手法です。遺伝子発現解析、遺伝子多型解析、SNP解析、ウイスル感染診断、ドラッグスクリーニング、RNAノックダウンの評価などさまざまなアプリケーションで用いられています。定量PCRが一般的な手法になる前には、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、PCR が用いられてきましたが、これらの実験では濃度既知のコントロールサンプルのバンドの濃さと相対比較することによって、サンプル中に含まれる目的の RNA・DNA量を算出していたため、正確に定量することができませんでした。定量PCRでは、増幅DNAを特定の一点だけで定量せず、増幅中の複数の点で測定します。増幅しているDNAが指数級数で増幅しているサイクル数では、増幅DNA量はサンプル中のDNA量に比例して増幅しており、このサイクルで蛍光により定量を行います。また、濃度の決定には濃度既知の複数の希釈系列サンプルを利用するため、定量はより正確に行われます。

定量PCRキットカタログ

定量PCR概要

テンプレートDNA

定量PCR を行うためには、PCR 溶液中にテンプレートとなるDNA が必要になります。SNP 解析などのゲノムDNAを解析する場合には、ゲノムDNA そのものか増幅したゲノムDNA をテンプレートとして用います。一方、RNA をサンプルとして特定のmRNA の発現量を解析する場合にはmRNA から逆転写反応によってcDNA を合成してテンプレートとして用います。

絶対定量と相対定量

サンプル中に存在する特定のDNA やRNA の量を測る方法には、絶対定量と相対定量の2 つの方法があります。絶対定量では、目的DNA の量を外部標準サンプルを基準として測定します。相対定量では、リファレンス（ハウスキーピング遺伝子など）に対する目的DNA の量の比率を算出し、数値を標準化させます。この標準化した数値によって複数のサンプル間での相対的な発現量を比較定量します。

絶対定量とは

絶対定量では、外部標準サンプルを用いて目的DNA 量を測ります。外部標準サンプルとして使用するDNA には、定量したい目的DNA と同一の配列が含まれていなければなりません（プライマ ーのアニールする配列も完全に一致させる必要があります）。希釈系列の外部標準サンプルの増幅曲線が指数関数的に増幅している領域でThreshold Cycle（Ct）値を求め、縦軸にCt 値、 横軸に希釈系列の外部標準サンプル濃度（log 値）をプロットすると直線の相関グラフが求められます。このグラフからサンプル中の目的DNA の濃度を算出します。

相対定量とは

相対定量では、目的DNA の定量PCR から求めたCt 値を、同一サンプル中のリファレンスのCt 値で割って標準化した数値を用い、複数の異なったサンプル間でこの数値を比較することにより相対的なDNA 量の差を解析することができます。このような相対的な定量解析は最も一般的に行われています。リファレンスとして頻繁に用いられるハウスキーピング遺伝子は、サンプルによっては発現量に変動がみられるため、複数のハウスキーピング遺伝子を検討し、最も発現変動の少ない遺伝子をリファレンスとして用います。

増幅DNA の選択とプライマーデザイン

再現性のあるデータを得るためには、効率的かつ特異的なDNA の増幅が必須となります。増幅DNA とプライマーの配列は定量PCR におけるDNA の増幅に非常に影響するため、増幅DNA の選択とプライマー設計を慎重に行う必要があります。

増幅DNA

  • 増幅するDNA の長さが短いほど増幅効率は高くなります。75 - 200 bp の長さになるよう選択してください。
  • 増幅DNA が二次構造をつくりやすいと増幅効率が低下するため、このような領域は避けるようにしてください。 mfold のようなソフトウェアを用いることにより、アニーリング温度での増幅DNA の二次構造を予測することができます。
  • 増幅DNA のGC 含有率が 50 - 60%の範囲になるようにしてください。GC 含有率がこれ以上に高くなると二 次構造を形成しやすくなります。
  • 増幅DNA には、4 塩基以上の連続した同一塩基配列を含まないようにしてください。

プライマー

  • プライマーはプライマー自身が二次構造をつくらないようにデザインしてください。
  • プライマーのGC 含有率を50 - 60%以上にしないでください。GC 含有率がこれ以上に高くなると二次構造や プライマーダイマーを形成しやすくなります。
  • プライマーの融解温度（Tm）を50 - 65℃にしてください。
  • 3 塩基以上の連続したG またはC が含まれないようにしてください。
  • 両プライマーの3' 末端が相補的にならないようにしてください。プライマーダイマーを形成する可能性があり ます。
  • プライマー配列と相同なDNA 配列が他に無いことをBLAST 検索で確認してください。

Thermo Scientific QPCR Master Mixesの特長

ホットスタート酵素

ABsolute QPCR、ABsolute Blue QPCR にはホットスタートタイプのThermo-Start Taq DNA Polymerase が入って います。Thermo-Start Taq DNA Polymerase は化学修飾タイプの Taq DNA polymerase で、PCR の最初のサイクル の熱変成前に95℃で15 分インキュベーションすることで酵素活性を示します。

青色Dye

ABsolute Blue 製品には、視認性を良くして反応溶液を調製しやすくした青色の色素が含まれています。

検出用蛍光物質

ABsolute QPCR、ABsolute Blue QPCR にはSYBRR Green I が含まれているタイプと、TaqMan プローブや Molecular Beaconなどのプローブ用として SYBRR Green Iを含んでいないタイプなど、さまざまな製品があります。

リファレンスDyes

リアルタイムPCR 装置にはROX 蛍光色素をリファレンスDye として用いるものがあります。ABsolute QPCR、 ABsolute Blue QPCR ではROX をあらかじめ含んだタイプと別チューブに分けたタイプの製品があります。また、 BioRad 社iCycler iQ 用にFluorescein をリファレンスDye として含んだタイプもあります。

QPCR Instrumentation

ABsolute QPCR、ABsolute Blue QPCR 製品は次にあげるリアルタイムPCR の装置にあわせた製品をご用意して います。 Applied BioSystems 社ABI PRISM 7000、7300、7500、7700、7900、7900HT、Bio-Rad 社 iCycler iQ、iQ5、 Chromo4、MiniOpticon、Agilent 社 Stratagene's MX4000、Mx3000P、Mx3005P system、Roche 社 Lightcycler 480、Eppendorf 社 Realplex system。

QPCR コントロール反応

定量PCRネガティブコントロール（鋳型DNAなし）

定量PCRの実験では、必ず鋳型DNA無しの反応を行ってください。このコントロール反応ではプライマーダイマー形成や反応溶液にコンタミネーションしたDNAがないことを確認することができます。

定量RT-PCRネガティブコントロール（逆転写反応コントロール）

定量RT-PCRの実験では逆転写酵素を含まない反応溶液からも反応を行ってください。このコントロールでは逆転写反応が起こらないため、サンプル中に含まれるゲノムDNAのコンタミネーションを確認することができます。

ポジティブコントロール

QPCR、 QRT-PCRのポジティブコントロールでは、プライマーセットが変わらない限りあらかじめ分注しておいた確実に増幅するサンプルを用いて反応を行ってください。定量PCR解析は定性解析と比べて全てのステップのわずかの差が最終結果に大きく影響します。反応に用いる試薬は水も含めて予定の実験回数分にあらかじめ分注しておくことをおすすめします。そして残った試薬は次回の定量実験では使用しないことをおすすめします。