B-PERMSDS 製品問合せ Pierce Catalog

Subcellular Protein Fractionation Kit

細胞成分ごとにタンパク質を分画抽出するキット

　哺乳動物の培養細胞から、細胞質タンパク質・膜タンパク質・水溶性核タンパク質・クロマチン結合タンパク質・細胞骨格タンパク質のそれぞれに段階的に分画抽出するためのキットです。各フラクション間のタンパク質のクロスコンタミネーションは15%以内に抑えられています。

Fig. 1

Fig.1 プロトコル概要
キットには4種類の抽出バッファー、 安定化ヌクレアーゼ、 プロテアーゼ阻害カクテル（Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail）が含まれています。最初に細胞に添加する抽出バッファーCEBは細胞膜の透過性を高めて水溶性の細胞質タンパク質を分画します。2番目の抽出バッファーMEBは細胞質膜・ミトコンドリア外膜/内膜・小胞体膜/ゴルジ体膜を分画しますが、核膜は溶解させません。いったん、核を遠心により回収した後、3番目の抽出バッファーNEBにより核から水溶性の核タンパク質を分画します。不溶性ペレットに3番目の抽出バッファーNEB+MNase(エンドヌクレアーゼ)を添加することでクロマチン結合型の核タンパク質を分画し、回収された不溶性ペレットに4番目の抽出バッファーPEBを添加することで細胞骨格タンパク質を分画します。

特長

  • 3時間以内に細胞質タンパク質・膜タンパク質・水溶性核タンパク質・クロマチン結合タンパク質・細胞骨格タンパク質に段階的に分画
  • 密度勾配を使用した超遠心は不要
  • 細胞ペレット20μlからの抽出50回分(キット全体では2グラムの細胞)
  • 各フラクションはウェスタンブロッティング、 総タンパク定量、,ゲルシフトアッセイ、 レポーターアッセイなどさまざまなアプリケーションで使用可能
細胞質   Fig 2 HSP90
細胞膜 Fig 3 EGFR
Fig 4 calreticulin

核

（水溶性）		 Fig 5 SP1
Fig 6 HDAC2
クロマチン   Fig 7 histone 3
 細胞骨格l Fig 8 vimentin
Fig 9 cytokeratin
18
    Fig 10  

ウェスタンブロッティングによる各フラクションマーカータンパク質の検出
HeLa 細胞 (2 x 10^6) をSubcellular Protein Fractionation Kitにより分画した。各フラクションを10μgずつ泳動し、各細胞内に局在するタンパク質マーカー(注)に対するウェスタンブロッティングにより、クロスコンタミネーションを確認した。検出にはThermo Scientific SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate (Product #34076)を用いた。

CE: cytoplasmic extract
ME: membrane extract
NE: nuclear extract
CB: chromatin-bound extract
PE: pellet extract

注）　細胞質タンパク質 (HSP90), 細胞質膜タンパク質 (EGFR), 小胞体タンパク質 (calreticulin), 核タンパク質(水溶性) (SP1 and HDAC2); クロマチン結合タンパク質 (histone 3); 細胞骨格タンパク質 (cytokeratin 18 and vimentin).

Cat.# 製品名 容 量 価格 MSDS
78840 Subcellular Protein Fractionation Kit
Suffi cient reagent for 50 cell preps.		 1 Kit ¥73,000 BID-P231
BID-P232
BID-P244