Background Eliminator for Film

S/N改善および露光過剰シグナルを除去するためのキット

Erase-It Background Eliminatorはウェスタン/ノーザン/サザンブロットなどのアプリケーションで露光したX線フィルム上のバックグランドを迅速かつ簡単に除去するユニークなシステムです。

高バックグランド, 影, 露光過剰バンド, シミはX線フィルムを使用した視覚化に特有な問題です。高いバックグランドや影は露光過剰, ブロッキング不充分, 不適当な濃度の酵素標識プローブや抗体により生じます。露光過剰なバンドは使用された酵素標識プローブや抗体の濃度が高すぎる場合や露光時間が長すぎた場合に見られる現象です。シミや影は酵素標識物の複合体や沈殿物がブロット上に形成された際に生じます。

Erase-Itはフィルム再露光や再実験を行わず、このような問題の全てを数分間で修正できます（図1, 2, 3）。露光したばかりのフィルムも数年間保管していたフィルムも使用することが可能で、フィルムの製造元も問いません。デンシトメーターによる（半）定量的なバンド濃度測定が要求されるアプリケーションに関しては、Erase-It Background Eliminatorはフィルム上のシグナルを全て均等に減少させるため、バンド間の相対的な強度（濃度）比は変わりません（図4）。

操作はシンプルです。露光済みのフィルムをErase-It反応液に浸し、希望するイメージに近づいたら、フィルムを純水でリンスして反応を停止してください。Erase-Itは迅速に反応して、通常2-3分間で理想的なシグナルレベルに到達します。

製品特長

フィルム上のシグナルを均等に減少
露光過剰なフィルム、シミや影のできたフィルムから迅速かつ簡便にバックグランドを消去
フィルムの製造元や露光フィルムの新旧に関わらずバックグランドを消去
再実験や再露光せずに理想的なイメージレベルに到達

Erase-It Eliminator Kit はX線フィルムを用いたイメージングを行うアプリケーションで使用できます。

SuperSignal化学発光基質やNorth2South化学発光検出キットを使用したウェスタンブロット, ノーザンブロット, サザンブロット
Pierce UnBlot Systems などのゲル内化学発光検出システム
Pierce LightShift Chemiluminescent EMSA Kit などの化学発光ゲルシフトアッセイ

図1 A431細胞ライセートを4-12% NuPage Gel (Novex)により電気泳動に供し、オーバーナイトでニトロセルロースに転写した。転写後のメンブランはSuperBlock Blocking Buffer in PBS (Product # 37515)による1時間のブロッキング後、1.25 ng/ml HRP標識mouse anti-phosphotyrosine (PY20)とのインキュベーションを1時間で行った。30分間の洗浄後、SuperSignal West Dura Substrate (Product # 34075)反応液を添加、X線フィルムの露光は10秒間で行い、露光過剰な完全に暗転したイメージ（A）を得た。Old Optionでは問題（完全に真っ黒になったフィルム）を解決するために、追加のゲルを用意してアッセイ条件を最適化した。分離したタンパク質はオーバーナイトで転写してメンブランは5% ドライミルクにより1時間ブロックした。ブロットは2.5 ng/ml HRP標識anti-phosphotyrosine (PY20)でプローブ、SuperSignal West Dura Substrate (Product # 34075)により化学発光検出した。露光時間10秒間でX線フィルムを感光させた。この最適化(B)には2日間を要した。New Optionでは真っ黒なフィルム（A）をErase-IT Background Eliminatorで処理、4分間でバンドが出現(C)した。

図2 組み換え型ヒトTNFαを4-20% SDS-PAGEゲルで電気泳動、ニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランのブロッキング後、Mouse anti-Human TNFαでプローブ、Goat anti-Mouse-HRP (Product # 31434)とSuperSignal West Dura Substrate (Product # 34075)で検出した。露光時間30秒間でフィルムの露光を行い、バックグランドにシミが生じたイメージ（A）を得た。フィルムをErase-It Background Eliminatorにより2分間処理することでバックグランドに生じたシミは消失した。

図3 組み換え型ヒトWild-Type p53 バキュロウィルス・ライセート　（バキュロ産生　ヒト型ｐ53？）を12% SDS-PAGEゲルで分離した。タンパク質をニトロセルロースメンブランに転写後、SuperBlock Blocking Buffer in PBS (Product # 37515)によりメンブランをブロッキングした。目的タンパク質はMouse anti-p53でプローブ、つづいてGoat anti-Mouse-HRP (Product # 31434) とSuperSignal West Pico Substrate (Product # 34080)により検出した。露光時間1分間でフィルムを感光（A）した。フィルム上のバンドは露光過剰であったが、Erase-It Background Eliminatorによる6分間の処理で改善された（B）。

図4 1,000, 250, 62.5, 15.6 pg のBiotinylated-BSA (Product # 29130) を用いてニトロセルロースメンブラン (Product # 77010) 上でドットブロットを作成した。作成したブロットはSuperBlock Blocking Buffer in PBS (Product # 37515)によりブロッキング、1/50,000希釈のSA-HRP (Product # 21126)と反応させた。30分間の洗浄後、SuperSignal West Pico Substrate (Product # 34080) とインキュベート、露光時間5分間でX線フィルム CL-XPosure Film (Product # 34092)を感光させた。バックグランドが生じたフィルムは各濃度のBiotinylated-BSAトリプリケートを含む4枚のストリップ状にカット、それぞれのストリップを個別にErase-Itで1, 2.5, 4 分間処理した。デンシトメーターによりストリップをスキャンした後、相対的なバンド強度を比較した。バンド強度はErase-It処理の時間とともに低下した。

* SuperSignal Technology is protected by U.S. Patent #6,432,662.

参考文献

Sancar, F. and Czajkowski, C. (2004). J. Biol. Chem. 279(45), 47034-47039.

製品情報
Buy	Cat #	製　品　名		容量	参考価格
Contact	21065	Erase-It Background Eliminator Kit Sufficient reagent to prepare approximately 3 liters of working solution. Kit contains:		Kit	¥24,500
		Erase-It Reagent A	100 ml
		Erase-It Reagent B	100 ml