Clean-Blot IP Detection Reagent and Kit

免疫沈降用抗体の干渉を受けずにバンドを検出するための試薬

免疫沈降サンプルのウェスタンブロットでは、免疫沈降に用いた抗体によってターゲットタンパク質のバンドがマスキングされてしまうことがあります。この原因は、従来の二次抗体が変性IgG （免疫沈降に用いた抗体）と非変性 IgG（ウェスタンブロッティングに用いた一次抗体）の両方を認識することにあります。Thermo Scientific Clean- Blot IP Detection Reagents は、変性 IgG とは結合せずに非変性IgG とだけ結合する試薬です。Clean-Blot IP Detection Reagents を酵素標識二次抗体の代わりに使用することで免疫沈降サンプルのウェスタンブロットにおいてもマスキングが解消され、ターゲットタンパク質のバンドを特異的に検出することが可能になります。

特長

動物種を問わず、さまざまな非変性抗体を認識
免疫沈降に使用するビーズへの抗体の共有結合固定化操作は不要
化学発光基質を使用した場合、メンブレンのストリッピングとリプロービングが可能
一次抗体の動物種に合わせた二次抗体の準備は不要
二次抗体の代わりに Clean-Blot IP Detection Reagent を使用するだけ
免疫沈降用抗体によるターゲットタンパク質バンドのマスキングを解消

注)1次抗体がMouse IgG1の場合、使用できません

表1 Clean-Blot IP Detection Reagent との適合性が確認されたモノクローナル抗体
適合性はドットブロッティングで確認しています。
生物種	アイソタイプ
Bovine	IgG2
Goat	IgG2
Human	IgG1, IgG2, IgG4
Mouse	IgG2a, IgG2b, IgG3
Rat	IgG2c
Rabbit	Total IgG
Sheep	IgG2

図1 免疫沈降によって単離した p53 タンパク質のウェスタンブロットレーン1-5はThermo Scientific Clean-IP Western HRP (HRP)、レーン6はgoat anti-mouse HRPでプローブした。レーン1: p53を発現させたA431細胞抽出物 (陽性コントロール), レーン2 および 3: 細胞ライセート未添加(陰性コントロール)の免疫沈降カラムの洗浄画分(L2)と溶出画分(L3), レーン4-6: 完全な免疫沈降の洗浄画分(L4)と溶出画分(L5, L6)

免疫沈降条件: p53を発現させたA431細胞の総ライセート(500 ug)にAnti-p53抗体 (2 μg)を添加、4℃にてオーバーナイトの震盪攪拌を行った。Protein A Agarose Resin (# 20333)を結合/洗浄バッファー (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP40, 5% glycerol; pH 7.5)で3回洗浄して、50% スラリーゲル (100 μl)を各チューブに添加、4℃で1時間の攪拌インキュベーションを行った後、未結合の蛋白質は遠心(1,000 x g, 1 min.)で回収、レジン-抗体-蛋白質の複合体を500 ul結合/洗浄バッファーにて3回洗浄した。p53蛋白質：抗体複合体はプロテインAレジンを30 ulの5X Lane Marker Reducing Sample Buffer (#39000)に懸濁、5分間ボイルした。ウエスタンブロット条件: Tris-glycineゲルで分離した蛋白質をPVDF膜 (#88158)に転写した。転写後の膜を 1% milk in TBST でブロック、一次抗体Mouse anti-p53 primary antibody (BD Biosciences, 1 μg/ml)に続き、Thermo Scientific Clean-IP Western HRP (HRP) (0.1 μg/ml)またはGoat Anti-Mouse HRP (#31430, 0.16 μg/ml)でプローブした。検出は化学発光基質SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (#34080)で行った。

図 2 マウス肝組織抽出物のウエスタンブロットマウス肝組織からの全蛋白質抽出物 (50 μg)をBio-Rad Criterion gelにより分離、PVDF膜に転写した後、1% milk in TBSTによりブロックした。ブロック後の転写膜はmouse monoclonal anti-Cdk1 (LabVision) (0.2 μg/ml)とgoat anti-mouse HRP (0.16 μg/ml)またはThermo Scientific Clean-IP Western HRP (HRP) (0.2 μg/ml)によりプローブした。

図 3 549細胞ライセートのラビット抗体による免疫沈降とウエスタンブロット Protein A/G アガロースとrabbit anti-NFkB (パネル A, B)またはrabbit anti-Bax (パネル C, D)を使用してA549細胞ライセートからのNFkBとBaxの免疫沈降を行った。goat anti-mouse HRPで検出したパネルAとCでは目的蛋白質はマスクされているが、Thermo Scientific Clean-IP Western HRP (HRP)で検出したパネルBとDでは目的蛋白質が検出されている

免疫沈降条件: NFkBとBaxを発現しているA549細胞ライセート4検体に対して4 ug の rabbit anti-NFkB (Upstate) または rabbit anti-Bax (Upstate) を添加、4℃でオーバーナイトの震盪攪拌を行った。Protein A/G Agarose (#20421)めBinding/Wash buffer (#28376)で3回洗浄した後、Binding/Wash buffer で調整した50% スラリーゲル 100 ulをマイクロチューブに添加、室温にて2時間の震盪攪拌を行った。未結合の蛋白質は遠心(2,500 x g, 1 min.)により回収した。レジン-抗体-蛋白質の複合体は500 ul Binding/Wash bufferで3回洗浄、Bax-抗体またはNFkB-抗体の複合体はProtein A/G Agaroseを150 μl の 5X Lane Marker Reducing Sample Buffer (#39000)に懸濁後、5分間ボイルして溶出させた。

ウエスタンブロット条件: Tris-HEPES Precise Protein Gels (#25244)により蛋白質を分離、PVDF (#88158)膜に転写した。転写後の膜をStartingBlock T20 Blocking Buffer (#37543)でブロックして、rabbit anti-NFkB または rabbit anti-Bax を1次抗体(1 ug/ml, Upstate)としてプローブした。続いて0.4 μg/ml Thermo Scientific Clean-IP Western HRP (HRP) (パネル B, D) または0.16 ug/ml Goat Anti-Rabbit HRP (#31460) (パネル A, C)でプローブした。NFkBとBaxは化学発光基質Pierce Western Blotting Substrateで検出した。

推奨検出試薬

化学発光基質 (HRP)	Clean-Blot IP Detection Reagent 推奨希釈率
SuperSignal West Femto	1:200 ～1:4,000 (1:4,000 ；　2.5 ul試薬を10mlのブロッキングバッファーに添加)
SuperSignal West Dura	1:200 ～ 1:2,000 (1:2,000 ;　5 ul試薬を10mlのブロッキングバッファーに添加)
SuperSignal West Pico	1:40 ～ 1:1,000 (1:1,000 ； 10 u試薬を10mlのブロッキングバッファーに添加)
Pierce Western Blotting Substrate	1:40 ～ 1:400 (1:400 ； 25 ul試薬を10mlのブロッキングバッファーに添加)

製品情報
Cat#	製　品　名	容量	参考価格
21230	Thermo Scientific Clear-IP Western HRP Conjugate	2.5 ml	¥34,500
21233	Clean-Blot IP Detection Reagent(AP)	2.5 ml	¥35,500