In-Gel Chemiluminescent Detection Kits

Pierce In-Gel Chemiluminescent は古典的なウェスタンブロッティングに替わる化学発光検出法です。タンパク質は泳動ゲル内で直接検出されるため、タンパク質を転写メンブランにトランスファーする必要がありません。タンパク質の転写を迂回することにより、ウェスタンブロッティングを短縮することができ、電気泳動からフィルムへの露光までが4時間以内に完了することになります。

製品特長:

転写不充分によるバラツキのない均一な検出・転写不可なタンパク質も検出、より正確なタンパク質レベルの提示が可能
抗体剥離や再プローブも可能
転写やブロッキングが不要
1 ngからの高感度な検出
メンブレンへの転写の難しいタンパク質の検出やタンパク質の発現レベルをより正確に検出
自作ゲルでの検出にも最適化
古典的なウェスタンブロッティングよりも迅速、操作時間の節約
古典的ウェスタンブロッティングに比べ非特異的な結合が低く、特異的バンドによる明瞭なイメージ
ゲル内検出後のゲル染色（全タンパク質の検出）も可能

タンパク質の転写プロセスにおける問題

Pierce In-Gel Technologyを使用する最も重要な利点として、サンプル内の相対的なタンパク質の量比を正確に反映できることにあります。SDS-PAGEにより分離されたタンパク質はメンブランに転写され、免疫化学的な処理を受けます。残念なことに、メンブランへの転写プロセスは選択的であり、タンパク質の性質やサイズに影響を受けます（文献1-3）。この選択性によりタンパク質の転写効率は影響をうけるため、ウェスタンブロット上で行われるタンパク質の相対レベルの定量的解析が不正確になり、本来は有用な定量的データも価値が損なわれることがあります。

ゲルからメンブランへの転写効率の低いタンパク質の検出実験

精製済みのGFP/6xHisタグ融合タンパク質とGFP/6xHisタグ融合タンパク質大腸菌（E. coli）ライセートをSDS-PAGEにより分離、ニトロセルロースメンブランへ通電により転写した。転写後のゲルに残存した未転写タンパク質は1:500希釈anti-Penta His抗体でプローブ、さらに1:250希釈goat anti-mouse抗体HRP標識との反応後、Pierce In-Gel Systemによりゲル内検出した。レーン 1-5: GFP/6xHisタグ融合タンパク質E. coliライセート (希釈倍率；左から順に1:100, 1:250, 1:1,000, 1:2,000, 1:4,000）, レーン 6-13: 精製済みGFP/6xHisタグ融合タンパク質 (添加量；左から順に12.5, 6.25, 3.12, 1.56, 1.0, 0.5, 0.1, 0.05 ng) レーン 14: 6xHisタグ付き分子量マーカー (希釈倍率1:16)

in gel #1

免疫化学検出後の全タンパク質の検出

メンブランに転写を行う従来法のウェスタンブロッティングに対するPierce In-Gel Technologyの利点として、特異的タンパク質の免疫化学的なゲル内検出後にゲル染色による総タンパク検出が行えることが挙げられます。Pierce In-Gel Technologyではタンパク質をゲル内で直接検出するため、GelCode Blue Stain Reagent (Product # 24592)やその他ゲル染色試薬による全タンパク質の染色も行うことができます。これにより、免疫化学的検出の特異性を示すことができます。

従来のPierce In-Gel Technologyの改良

従来、ピアスの研究者は2-Stepシステム(1次抗体/2次抗体HRP標識, または1次抗体ビオチン標識/ストレプトアビジンHRP標識を使用)や1-Stepシステム(1次抗体HRP標識, 文献4, 5)を使用したプレキャストゲル内での検出に関してのみ言及していました。これは、従来のIn-Gel Technologyが自作のビスアクリルアミドゲルには対応しておらず、また標準的な化学発光検出法ほど感度は高くなかったことが理由です。私達は自作のビスアクリルアミドゲルでの抗原の検出に関して最適化を行い、メンブラン上での標準的な化学発光検出に匹敵する感度を実現しました。

新しい方法では自作ゲルはシリコナイズされたガラスプレートかディスポーザブル・プラスチック製カセットに流し込みます。シコナイズされたガラスプレートで調整されたゲルは50%メタノールによる前処理が、プラスチック製カセットで調整されたゲルは50%イソプロパノールによる前処理が、それぞれ必要になります。ビスアクリルアミドの重合ではSDSが自作のゲルでは通常使用されますが、重合反応でのSDS添加は特に利点もなく、私達はSDSを添加しない重合反応を推奨しています。SDSを含まないゲルは非変性条件でも変性条件でも使用できます。

自作ゲルとプレキャストゲルにおけるPierce In-Gelテクノロジーの比較
In-Gel Technique Used	Standard homemade gel	Homemade gel cast in a plastic cassette	Pre-cast Gels
シリコン処理	必要	不要	不要
SDSの有無	不要	不要	関係なし
アルコールによる前処理	メタノール	2プロパノール	2プロパノール

in gel #2

図2Pierce In-Gel Chemiluminescent Detection Kit for GST-tagged Proteins (Product # 33515)による自作ゲル内でのGST検出とウェスタンブロッティング用の標準的な化学発光検出試薬を使用したウェスタンブロッティングの比較
精製済みタンパク質GSTとGSTライセートを自作ゲルを用いたSDS-PAGEにより分離した。図3A. ゲルはシリコナイズされたガラス製プレート内でキャストして、電気泳動後に50％メタノールによる前処理を施した。図3B. ゲルは処理済みのプラスチック製カセット（Invitrogen）内でキャストして、電気泳動後に50％イソプロパノールを用いて前処理を施した。両ゲルはAnti-GST-HRP conjugate (0.4 µg/ml)によりプローブした。図3C. ゲルは電気泳動後、ニトロセルロースメンブランに転写されAnti-GST-HRP conjugate (0.4 µg/ml)によりプローブした。レーン1-3. 左から順に10 ng, 25 ng, 50 ng 精製GST (Santa Cruz). Lanes 4-7: 左から順にId1:GST lysate 1:1, Id2:GST lysate 1:1, Id3:GST lysate 1:10 (BD PharMingen), Bir2/GST lysate (1:200)。

自作ポリアクリルアミドゲルでの抗原と抗体の結合は抗体剥離バッファーのRestore Western Blot Stripping Buffer (Product # 21059)による処理で乖離させることができます。この剥離バッファーは1次抗体, 2次抗体, および検出試薬を免疫化学的な処理を受けたゲルから除去、異なる抗体や異なる抗体濃度での再プローブを可能にします。限られたサンプル量で抗体希釈率の最適化が必要な場合や同一ゲルで2つの異なる抗原の解析を行う場合、ゲルからの抗体剥離/再プローブは有用な手法です。ビオチン標識抗体とストレプトアビジンHRPを用いた自作ゲルのプローブも可能です。また、免疫化学的検出の後、ゲルを洗浄してGelCode Blue Protein Stain Reagentによりゲル染色を行うこともできます。

参考文献:

Lin, W. and Kasamatsu, H. (1983).On electrotransfer of polypeptides from gels to nitrocellulose membranes. Anal. Biochem. 128, 302-311.
DenHollander, N. and Befus, D. (1989). Loss of antigens from immunoblotting membranes. (1989) J. Immunol. Methods 122, 129-135.
Reddy V.M. and Kumar B. (2000). Interactions of Mycobacterium avium complex with human respiratory epithelial cells. J. Infec. Dis. 181, 1189-1193
Desai, S., Dworecki, B. and Cichon, E. (2001). Direct immunodetection of antigens within the precast polyacrylamide gel. Anal. Biochem. 297, 94-98.
Desai, S., Dworecki, B. and Cichon, E. (2002). Direct immunodetection of proteins within polyacrylamide gels. J. Bioluminescence and Chemiluminescence, manuscript accepted for publication.
Roberts, K.P., Ensrud, K.M., and Hamilton, D.W. (2002) A comparitive analysis of expression and processing of the rat epididymal fluid and sperm-bound forms of Proteins D and E. Biol. Reprod. 67:525 - 533

製品情報
Cat #	製　品　名		容量	参考価格	MSDS
33500	Pierce In-Gel Chemiluminescent Detection Kit - Rabbit　 Sufficient reagents to perform 10 mini-gel detections		Kit	¥83,000	BID-P172
	Stable Peroxide	55 ml
	Luminol Enhancer	55 ml
	Stabilized Goat Anti-Rabbit-HRP	10 µl
	Dilution Buffer	50 ml
	BupH Pack PBS Buffer	17 packs
	Tween-20	5 x 10 ml vials
	Incubation Colander	1 unit
	CL-XPosure Film (5 x 7)	25 sheets
33505	Pierce In-Gel Detection Kit - Mouse　 Sufficient reagents to perform 10 mini-gel detections		Kit	¥83,000	BID-P172
	Stable Peroxide	55 ml
	Luminol Enhancer	55 ml
	Stabilized Goat Anti-Mouse-HRP	10 µl
	Dilution Buffer	50 ml
	BupH Pack PBS Buffer	17 packs
	Tween-20	5 x 10 ml vials
	Incubation Colander	1 unit
	CL-XPosure Film (5 x 7)	25 sheets
33550	Pierce In-Gel Chemiluminescent Substrate		110 ml	¥65,000	BID-P119
33499	Hands-Off Incubation Colander		1 unit	¥8,000