O-GlcNAc Western Blot Detection Kit

O-GlcNAc糖鎖修飾のウェスタンブロット化学発光検出キット

o-glcnac

糖鎖修飾とリン酸化は、細胞応答を制御するシグナル伝達経路系で重要な役割を果たすことから、最も広範囲に研究されている翻訳後修飾といえます。セリンまたはスレオニン残基へのO-結合型糖鎖修飾はほぼ全ての真核細胞で確認されており、この特異的な翻訳後修飾を受けたタンパク質は細胞質内および核内で確認できます。まだ正確には判っていませんが、β-O-結合型N-アセチルグルコサミン (O-GlcNAc)修飾は多量体形成におけるタンパク間の相互作用調節やタンパク分解に対する防御において機能しているようです。O-GlcNAc修飾は多くの点でリン酸化に関与しているようにも思えます。明らかにO-GlcNAc修飾はリン酸化と同様に制御されており、現在知られているO-GlcNAc修飾化タンパク質は全て、リン酸化タンパク質でもあります。さらに、この二つの重要な翻訳後修飾は同一のタンパク質上で明らかに相互補完的な関係にあり、それゆえO-GlcNAc修飾は注目されています。

モノクローナル抗体によるO-GlcNAcに対する高い特異性

Pierce O-GlcNAc Western Blot Detection Kitではメンブラン上でO-GlcNAc翻訳後修飾の検出を可能にする最高度に特異的なマウスモノクローナル抗体が使用されています。キットでのモノクローナル抗体の反応はβ-O-結合型セリンまたはスレオニンGlcNAcに限定されます。α-O-GlcNAc, α/β-O-GalNA修飾, N-結合型オリゴ糖との交叉反応は確認されていません。

迅速かつ高感度な化学発光検出

Pierce SuperSignal West Dura Extended Duration Substrateを使用した高感度な化学発光検出は転写ブロットのX線フィルム露光後、1分間以内のO-GlcNAc修飾タンパク質の視覚化を可能にします。迅速検出に加え、ピコモル低域での高感度検出が可能です。

Jurkat細胞ライセートでのキット性能評価

キットには、培養細胞タンパク抽出試薬M-PER Mammalian Cell Lysis Reagent, anti-IgM抗体HRP標識, ブロッキングバッファー, 洗浄バッファーが含まれ、これら全ての内容物の機能は確認済みです。

Jurkat細胞抽出物からのO-GlcNAc修飾タンパク質の検出

o-glcnac

図1 SDS-PAGEで分離されたO-GlcNAc修飾タンパク質のウェスタンブロット検出
Jurkat細胞は10% ウシ胎児血清(FBS)添加RPMI 1640培地で浮遊培養した。終濃度で50 µMの PUGNAc [O-(2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene) amino N-phenylcarbamate]と4 mMのグルコサミンによる3時間の細胞処理を行い、プロテアーゼ阻害剤(Cat # 78410)を添加したM-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Cat # 78501)により細胞抽出物を調整した。抽出物25µgを10% SDS-PAGEゲル上で電気泳動、タンパク質を分離した。GelCode Blue Stain Reagent (Cat # 24590)による総タンパク質に対するゲル染色(右パネル)を行ったあと、ニトロセルロース膜への通電によるトラスファーを行い、CTD 110.6 (an O-b-GlcNAc-specific monoclonal antibody) でプローブ、適当な2時抗体HRP標識とのインキュベーション後、SuperSignal West Dura Substrateによる化学発光検出(左パネル)を行った。レーン 1-4はJurkat細胞抽出物, レーン 5, 6, 7は陰性コントロールの ovalbumin (5 µg), fetuin (5 µg), O-β-GalNAc修飾 BSA (10 ng), レーン8は O-beta-GlcNAc修飾 BSA (5 ng, 陽性コントロール)。 (+) および (-) はPUGNAc と glucosamineによる処理の有無を表し、M はPierce Blue Protein Molecular Weight Marker Mix(Cat # 26681)を表す。

項目	特長
Kit includes MAb CTD 110.6, the most specific monoclonal antibody for the detection of b-O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc)	キットではβ-O-結合型N-アセチルグルコサミン (O-GlcNAc)の検出で最も特異的なモノクローナル抗体MAb CTD 110.6を使用、サンプル中の ß-O-GlcNAc 修飾タンパク質のみを検出。（α-O-結合型GlcNAcとの交叉反応なし）
Kit includes sufficient reagents and accessories for 10 Western blot detections from mini-gels	転写膜とX線フィルム以外の必要な試薬がキットには含まれ、ミニゲル10枚分の検出に充分。
Kit includes M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	培養細胞から効率的にタンパク質を抽出するM-PER Mammalian Protein Extraction Reagentが含まれる。
Kit includes super-sensitive, patented SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate	β-O-GlcNAc修飾部位での複合体（抗原‐1次抗体-2次抗体HRP標識）を高感度(ピコモル低域)で検出できるように化学発光基質SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrateとの最適プロトコール

General O-GlcNAc Western Blot Detection Protocol

o-glcnac

関連製品情報
Cat #	製　品　名	容量	参考価格	MSDS
88013	Nitrocellulose Membrane (7.9 cm x 10.5 cm), 0.2µ	15 sheets/pkg.	¥22,000	BID-P135
88024	Nitrocellulose Membrane (8 cm x 8 cm), 0.2µ	15 sheets/pkg.	¥20,000	BID-P135
77012	Nitrocellulose Membrane (8 cm x 12 cm), 0.2µ	25 sheets/pkg.	¥49,000	BID-P135
34092	CL-XPosure^TM Film (5" x 7" noninterleaved sheets)	25 sheets/pkg.	販売終了
34090	CL-XPosure^TM Film (5" x 7" noninterleaved sheets)	100 sheets/pkg.	¥21,000
34093	CL-XPosure^TM Film (8" x 10" noninterleaved sheets)	25 sheets/pkg.	¥23,000
34091	CL-XPosure^TM Film (8" x 10" noninterleaved sheets)	100 sheets/pkg.	¥38,000

参考文献

Rex-Mathes, M., et al. (2002). Immunological detection of O-GlcNAc. In Posttranslational Modification of Proteins. Tools for Functional Proteomics, Kannicht, C., Ed.; Humana Press: Totowa, N.J., pp.73-87. (Cat # 20064)
Comer, F.I. and Hart, G.W. (2000). O-Glycosylation of nuclear and cytosolic proteins. Dynamic interplay between O-GlcNAc and O-phosphate. J. Biol. Chem. 275(38): 29179-29182.
Comer, F.I., et al. (2001). Characterization of a mouse monoclonal antibody specific for O-linked N-Acetylglucosamine. Anal. Biochem. 293: 169-177.

製品情報
Cat #	製　品　名		容量	参考価格	MSDS
24565	O-GlcNAc Western Blot Detection Kit Sufficient material to develop up to 10 mini-blots		Kit	¥90,000	BID-P107
	M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	25 ml
	Dilution Buffer (10X) – Blocking Buffer,	2 x 50 ml
	BupH Phosphate Buffered Saline	17 packs
	Surfact-Amps 20 (10% Tween-20 solution)	3 x 10 ml
	O-GlcNAc Western Blot Positive Control	100 mg
	Anti O-GlcNAc Monoclonal Antibody (MAb CTD 110.6) in ascites	100 µl
	Goat anti-Mouse IgM(µ), HRP Conjugate	75 µg
	SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	100 ml

Note: This Western blot kit is shipped in a single box as a two-part kit. Part A contains some components that require storage at 4°C or -20°C upon arrival. Part B contains only the O-GlcNAc-specific monoclonal antibody. This MAb is shipped on dry ice to ensure it maintains integrity during transit. Upon its arrival, store it at -20°C.