Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer

高アフィニティ抗体の剥離用　レストア・プラス

室温で保管されたボトルから希釈せずに使用できるReady-to-Useな製品です。

ウエスタンブロットからの抗体剥離を必要とする場合、私達は Restore Western Blot Stripping Buffer (#21059) を最上のバッファーとして推奨してきました。しかし、Restoreを使用してもブロットからの剥離が困難で反応時間の延長や22℃以上の反応温度が必要な抗体があることも判っていました。Restore PLUS では「高アフィニティ抗体」を迅速かつ効果的にブロットから剥離、もちろん転写された蛋白質（抗原）は除去しません。複数回のプロービングが可能です。 Restore PLUS は室温で保管されたボトルから希釈せずに使用できるReady-to-Useな製品です。ニトロセルロース膜やPVDF膜からも効果的に抗体を剥離、様々なブロッカー、酵素標識抗体、そして化学発光基質に対応します。抗actin抗体のような比較的親和性の高い抗体（高アフィニティ抗体）の剥離を確実に行う一方で転写された抗原には穏かなピアス独自の組成です。

特徴/利点:

Ready-to-use で Easy-to-Use
- 使用前の希釈が不要
- 不快な臭気も無し
- 室温での保管が可能
一般的に使用されるウエスタンブロッティング試薬に対応
- ウェットまたはドライで保存されたニトロセルロース、PVDF膜
- アルカリフォスファターゼ標識抗体、ペルオキシダーゼ標識抗体
- お手持ちのブロッキングバッファー、化学発光基質
優れた費用対効果
- 時間とサンプルを節約
- 効果的にブロットを剥離
確実な剥離と穏かな組成
- 転写された蛋白質(抗原)は維持
- ブロットは最大5回まで剥離
フレキシブルな用途
- 抗体濃度の最適化
- 同一ブロット上での検出対象の変更

プロトコル概要:

ブロットを洗浄して化学発光基質を除去
Restore PLUSでインキュベーション（5-15 min ＠室温）
ブロットを取り出し、洗浄バッファー（TBST, PBST）で洗浄
ブロッカーで再ブロック
抗体の剥離を試験
新規抗体または新規濃度によりプローブ

図1. 抗体剥離と再プローブ HeLa細胞ライセート(レーン1, 2, 3 に 4, 2, 1 ug を添加)のニトロセルロース膜ウエスタンブロットを 0.4 ug/ml Mouse Anti-human actin (U.S. Biological) と 100 ng/ml Goat Anti-Mouse Secondary Antibody, HRP conjugate (#31430) でプローブ、ピアス　ECL Substrate (#32209, パネル 1A ) による化学発光検出で行った。ブロットからの抗体剥離は 5 ml の Restore PLUS または競合製品により室温で15分間行い、抗体剥離の確認を行った(パネル 1B)。TBSTにより洗浄したブロットを StartingBlock T20 Blocking Buffer in TBS (#37543) で再ブロック、0.25 ug/ml Rabbit Anti-Cyclophilin B (Abcam) および 0.2 ug/ml Goat Anti-Rabbit-HRP (#31460) で再プローブ、 Pierce ECL Substrate, (Panel 1C) で検出した。パネル1B（剥離ブロット）や1C（Cyclophilin B）では1回目のプローブから剥離されずに残ったアクチン抗体：HRP標識二次抗体によるシグナルがCompetitorで検出されていることが判る。

図2. 抗体剥離および再プローブによる抗体濃度の最適化ニトロセルロース膜(パネルA)およびPVDF膜(パネルB)を転写膜として使用したHeLa細胞ライセート(レーン 1, 2, 3 に 4, 2, 1 ug を添加) のウエスタンブロット分析をSuperSignal West Dura Substrate (#34076) による化学発光検出で行った。ブロットは0.25 ug/ml rabbit anti-cyclophilin B (Abcam) および 200 ng/ml Goat Anti-Rabbit-HRP (#31460) によりプローブ(パネル 1A および 1B)した。各ブロットは 5 ml の Restore PLUS により室温での15分間の抗体剥離を行った(パネル 2A および 2B)。TBST洗浄後 StartingBlock T20 Blocking Buffer in TBSでブロック、100 ng/ml rabbit anti-cyclophilin B (Abcam) および 4 ng/ml Goat Anti-Rabbit-HRP で再プローブした(パネル 3A および 3B)。抗体濃度を下げた3Aおよび3Bではバックグランドノイズが減少しているのが判る。

図 3. アルカリフォスファターゼ酵素標識物による再プローブ HeLa細胞ライセート (レーン1, 2 ,3 に 4, 2, 1 ug を添加) のPVDF膜ウエスタンブロット(A および B)を 0.5 ug/ml rabbit anti-NF kB (Upstate) と 50 ng/ml Goat Anti-Rabbit-AP (#31340) でプローブして LumiPhos WB Substrate (#34150, パネル1Aおよび1B) による化学発光検出を行った。ブロットBは 5 ml Restore PLUS による室温での15分間の抗体剥離に供され、TBST洗浄後に StartingBlock T20 Blocking Buffer in TBS (#37543, パネル2)により再ブロックされた。コントロール(ブロットA)および剥離ブロット(ブロットB)の両ブロットは 0.5 ug/ml mouse anti-human GAPDH (Chemicon) と 50 ng/ml Goat Anti-Mouse-AP (#31320) により再プローブされた(パネル3)。既に1回剥離され再プローブされたブロットBは 5 ml Restore PLUS による室温での15分間の2回目の剥離に供された(パネル4)。TBSTにより洗浄後 StartingBlock T20 Blocking Buffer in TBS により再ブロックされた。コントロールおよび剥離ブロットの両ブロットは 0.5 ug/ml rabbit anti-cyclophilin B (Abcam) および 50 ng/ml Goat Anti-Rabbit-AP (3E)でプローブした。全てのブロットBで目的バンドのみが検出されているのが判る。

図 4. リン酸化蛋白質と非リン酸化蛋白質の検出 EGF刺激A431細胞ライセート(レーン 1, 2, 3 に 4, 2, 1 ug を添加) のニトロセルロース膜ウエスタンブロットを Pierce ECL Substrate (#32209) で化学発光検出した。ブロット1Aおよび1Bには 1 ug/ml anti-phospho MAP1/2 (Erk 1/2), clone 12D4 mouse monoclonal (Upstate) および 200 ng/ml Goat Anti-Mouse-HRP (#31340) によるリン酸化型MAPK1/2に対するプローブが行われた。ブロットBには 5 ml Restore PLUS による室温での15分間の抗体剥離(パネル2)が行われ、0.5 ug/ml anti-MAP Kinase 1/2 (Erk 1/2) rabbit polyclonal (Upstate) と 200 ng/ml goat anti-rabbit-HRP (#31460) による非リン酸化型MAPK1/2 に対する再プローブ(ブロット3B)が行われた。ブロット3Aは非リン酸化型MAPK1/2に対するプローブのみ行われたコントロールとなる。

Reference

Kaufmann, S.H., et al. (1987). Anal. Biochem. 161, 89-95.
Kaufmann, S.H. and Kellner, U. (1998). Erasure of Western blots after autoradiographic or chemiluminescent detection. In Immunochemical Protocols. Ed. Pound, J.D. Humana Press, Totowa, NJ, 223-235.
Schrager, J.A., et al. (2002). J. Biol. Chem. 277, 6137-6142. Sorci, G., et al. (2003). Mol. Cell. Biol. 23, 4870-4881.

Cat.#	製品名	Pkg.	参考価格	MSDS
46428	Restore^TM Plus Western Blot Stripping Buffer （８cmｘ１０cmのミニゲル　１～２枚分）	30ml	¥7,800	BID-P216 BID-P299
46430	Restore^TM Plus Western Blot Stripping Buffer （８cmｘ１０cmのミニゲル　２５枚分）	500ml	¥25,500	BID-P216 BID-P299