Human In Vitro Protein Expression Kit
ヒト細胞由来の翻訳システムを利用した無細胞タンパク質合成キット
Thermo Scientific Pierce In Vitro Protein Expression Systems は、ヒト細胞の抽出液を用いて組換えタンパク質を合成するためのシステムです。生細胞システム（昆虫細胞系、大腸菌系、酵母系）では時間（1日から1週間以上）と手間のかかるタンパク質合成を短時間で手軽に行うことができます。また生きた細胞では毒性のあるタンパク質についても、合成が可能です。
哺乳類由来の無細胞タンパク質合成システムとして古くから利用されているウサギ網状赤血球系と比べてタンパク質合成効率が高く、mRNAを含む転写反応液の添加によりタンパク質合成収量を増加させることが可能です（図1）。
特長
- 250 kDa以上のマルチドメインタンパク質が合成可能
- バッチ反応系で40 µg/mlレベルのタンパク質合成が可能（GFPの場合）
- エネルギー源、特別なタンパク質、mRNAの添加(スパイク）で6時間以上反応が持続
- 標準プロトコル（バッチ系）で翻訳反応時間は90分
- ウイルスからヒトを含む高等生物までさまざまなな種に由来するタンパク質が合成可能
アプリケーション
- タンパク質間またはタンパク質-DNA（RNA）間の相互作用解析
- 非天然アミノ酸標識したタンパク質の合成
- 細胞毒性タンパク質の合成
- タンパク質機能解析
- ミュータントタンパク質の合成
図1 Pierce Human In Vitro Systemとウサギ無細胞系におけるluciferase合成効率とスパイク効果の比較
ヒト細胞ライセートを50%含むタンパク質合成反応液（Human In Vitro System）とウサギ網状赤血球ライセートを66%含むタンパク質合成反応液（ウサギ無細胞系）をそれぞれ30℃でインキュベーションしてluciferaseを合成しました。Human In Vitro SystemではmRNAを含む転写反応液を鋳型として添加しています。ウサギ無細胞系ではDNAを鋳型として添加しています（共役系）。反応開始から1.5時間、2.5時間、3.5時間、5.5時間、8時間後に各反応液からサンプリングを行って Luciferaseの合成量を測定しました。ウサギ無細胞系では1.5時間程度でほとんどタンパク質合成が停止するのに対して、Human In Vitro Systemでは3時間以上タンパク質合成が続きました。また、矢印の時間に luciferaseのmRNAを反応液に添加（スパイク）した場合、ウサギ無細胞系ではスパイクしない場合に比べてLuciferaseの合成量に差は確認されませんでしたが、Human In Vitro Systemでは合成量が約30%増加しました（黄色のグラフ）。
図 2 Pierce Human In Vitro Systemおよびウサギ無細胞系により、[35S]-methionineの取り込み合成を行ったluciferaseタンパク質のSDS-PAGE（オートラジオグラム）
Pierce Human In Vitro Systemの反応液25µに10µCiの[35S]-methionineと1µgのmRNAを添加して90分間インキュベーションした後、それぞれ4µlをサンプリングして4-12% SDS-PAGEにより分離しました。Thermo Scientific GelCode Blue Stain Reagent (Product # 24590)を用いて染色および脱染色したゲルをセロファンシート上で乾燥し、X線フィルムに 3時間露光しました。ウサギ無細胞系については市販品のプロトコルに従い、製品に添付のコントロールDNAおよび[35S]-methionineを添加して同様の実験を行いました。いずれの系でも予想されるluciferaseのサイズ（62 kDa）の位置にバンドが確認されましたが、ウサギ無細胞系では他のサイズのバンドも複数確認されました。
図 3 Pierce Human In Vitro Systemおよびウサギ無細胞系により合成したGFPのウェスタンブロット解析
各無細胞システムを用いて合成したGFP翻訳反応液を4-12% SDS-PAGEにより分離後、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーしました。プローブとして抗GFP抗体を用い、検出試薬としてThermo Scientific SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate (Product # 34075)を用いてGFPのバンドを検出したところ、ウサギ無細胞系ではGFP以外のさまざまなバンド（バックグラウンド）が検出されましたが、Human In Vitro Systemでは予想されるGFPのサイズ（27 kDa）の位置に特異的なバンドが検出されました。
キットに共通のコンポーネント:
- Lysate for Protein Expression
- Accessory Proteins
- Energy Mix
- Salt Solution
- Amino Acid Mix – Leu
- Amino Acid Mix – Met
- Amino Acid Mix – Cys
- RNase Inhibitor
- Positive Control DNA: pCFE-GFP
- Nuclease-free Water
| Cat# | 製 品 名 | 容 量 | マニュアル | 価 格 | MSDS |
| 88855 | Human In Vitro Protein Expression Kit - DNA For use with DNA templates Includes general kit contents listed above and: Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase |
50 反応 |  |
販売終了 ⇒Refer to 88881 |
BID-P271 |
| 88856 | Human In Vitro Protein Expression Kit - DNA For use with DNA templates Includes general kit contents listed above and: Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase |
10 反応 | |
販売終了 ⇒Refer to 88882 |
BID-P271 |
| 88857 | Human In Vitro Protein Expression Kit - mRNA For use with mRNA templates Includes general kit contents listed above |
50 反応 | |
販売終了 ⇒Refer to 88883 |
BID-P271 |
| 88858 | Human In Vitro Protein Expression Kit - mRNA For use with mRNA templates Includes general kit contents listed above |
10 反応 | |
販売終了 ⇒Refer to 88884 |
BID-P271 |
| 88899 | Recombinant GFP Protein | 20µg | ¥18,000 |
