細胞へのsiRNA導入 FAQ

お客様からいただくご質問をまとめました。
その他ご質問などございましたら、 製品問い合わせ先ページよりお願いいたします。

Q1:　　siRNAを細胞に導入する方法にはどのようなものがありますか。

siRNAを細胞に導入する方法としては、脂質ベースのトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクション法、ベクターを用いた導入法などがあります。接着細胞を実験対象とする場合には、脂質ベースのトランスフェクション法が一般的に用いられています。浮遊細胞へのトランスフェクションでは、脂質ベースのトランスフェクション法は比較的困難ですが、エレクトロポレーション法を用いることでより効率的に導入することができます。また、細胞に受動的に取り込まれる特殊修飾基を導入したAccell siRNAを用いる方法では、接着細胞、浮遊細胞などのさまざまな細胞へトランスフェクション試薬なしに導入できることを確認しています。

サーモフィッシャーサイエンティフィックでは、脂質ベースのトランスフェクション試薬としてDharmaFECTを提供しています。DharmaFECTは、さまざまな細胞株へ効率よくsiRNAを導入するために至適化された4種類のトランスフェクション試薬です。DharmaFECTの詳細については製品カタログからご覧ください。また、トランスフェクション試薬などを用いない、Accell siRNAについては製品カタログからご覧ください。

Q2:　　siRNAを細胞へ導入するとき、どのようなトランスフェクション試薬を使うのがいいですか。

トランスフェクション試薬は、使用する細胞株にあわせて最適なものを選ぶ必要があります。サーモフィッシャーサイエンティフィックでは、細胞にあわせて至適条件で使い分ける、4種類の脂質ベースのトランスフェクション試薬（DharmaFECT）を提供しています。DharmaFECTは、高いsiRNA導入効率、低い細胞毒性、再現性の高い結果を実現します。詳細ついては製品情報およびプロトコルをご覧ください。お使いの細胞株に対するプロトコルがない場合、お使いの細胞株に対するトランスフェクション方法について、PubMedやHighWireなどの検索サイトにより関連文献を調べることをおすすめします。

Q3:　　最適なトランスフェクション試薬はどのように選べばいいですか。

細胞毒性が低く、siRNAが効率よく導入できるトランスフェクション試薬が最適です。siRNAの導入効率は、ポジティブコントロールsiRNAを用いて、そのターゲット遺伝子のmRNAレベルのノックダウン効率から見積もります。サーモフィッシャーサイエンティフィックでは、脂質ベースのsiRNA用トランスフェクション試薬としてDharmaFECTをおすすめします。DharmaFECTは、さまざまな細胞株へ効率よくsiRNAを導入するために至適化された4種類の製品です。DharmaFECTの詳細についてはカタログをご覧ください。

Q4:　　トランスフェクション効率を迅速に測定する方法はありますか。

サーモフィッシャーサイエンティフィックでは、siGLO (Green/Red) Transfection Indicatorなど、いくつかの蛍光標識コントロールsiRNAを提供しています。siRNAの細胞への取り込みは、共焦点蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーで適切なフィルターを用いて観察することができます。siGLO (Green/Red) Transfection Indicatorについて、蛍光強度が最大となるとき（取り込みが最大になるとき）にsiRNAのトランスフェクション条件が最適になることを確認しています。siGLO Transfection Indiciatorの詳細については、製品カタログからご覧ください。

Q5:　　トランスフェクションにより多くの細胞が死滅します。どうしたらよいでしょうか。

トランスフェクション後の細胞生存率が低い場合には、トランスフェクション条件の至適化が必要です。トランスフェクション条件の至適化で検討しなければいけない事項は、トランスフェクション試薬（種類）、細胞株ごとの条件、たとえばsiRNAとトランスフェクション試薬との比率、トランスフェクション時の細胞密度、細胞継代数、トランスフェクション試薬のロット、トランスフェクション後の培養時間などです。トランスフェクション試薬の濃度を低くすることや、トランスフェクション後の培養時間を短くすることによって、細胞への毒性を最小限に抑えられる場合があります。また、実験結果がばらつくときは、トランスフェクション試薬の品質がロット間でばらついている可能性も考えられます。上記の点について検討しても問題が解決しないようでしたら、他のトランスフェクション試薬を試すか、テクニカルサポートまでお問い合わせいただくことをおすすめします。

Q6:　　トランスフェクション効率の至適化は重要なのですか。

トランスフェクション効率とは、細胞内にsiRNAを取り込んだ細胞の割合のことです。トランスフェクション効率が低いと、siRNAが導入されていない細胞由来のmRNAの発現が全体として観察されるmRNAのレベルを押し上げてしまうため、見かけ上の遺伝子発現抑制効果が弱く観察されることになります。

Q7:　　siRNAをトランスフェクションしましたが、遺伝子発現抑制効果がmRNA発現レベルで75％に達しません。なにが原因でしょうか。

遺伝子発現抑制が不十分なときの主な原因としては、トランスフェクション効率が低いことと、siRNAのデザインが適切でないことの２点が考えられます。この場合はまずポジティブコントロールsiRNAを用いて、トランスフェクション条件の至適化を行います。トランスフェクション条件を検討しても遺伝子発現抑制が中程度もしくは低い場合には、他のトランスフェクション試薬や方法（例えば、エレクトロポレーション法など）の利用を検討します。細胞株によっては導入効率が改善することがあります。

トランスフェクション効率を至適化した条件においてもターゲット遺伝子の発現抑制が不十分な場合は、siRNAの配列デザインに問題のある可能性があります。従来のsiRNA配列デザインルールや、一般に公開されている配列デザインツールでデザインしたsiRNAの遺伝子発現抑制機能には、大きなばらつきが見られることがあります。siRNAの配列デザインが原因で遺伝子発現抑制が低い場合には、サーモフィッシャーサイエンティフィックのSMARTselectionアルゴリズムおよびSMARTpoolテクノロジーに基づくsiRNA製品のご使用をおすすめします。