ABgene FAQ

標準的なPCR には ThermoPrime Taq DNA Polymerase をおすすめします。Long PCR やエラー率の低いPCR を行う場合は、2 つの酵素を組み合わせた Extensor Hi-Fidelity PCR Enzyme をおすすめします。また、GC リッチな配列を含む場合やDNA テンプレートへの特異性を高めたい場合には、高温活性化型のThermo-Start Taq DNA Polymerase をおすすめします。

ThermoPrime Taq DNA Polymerase にはアンモニウムイオンをベースとしたBuffer IV を添付しています。Buffer IV を用いることによってPCR 産物の収量が高くなります。また、KCl をベースとしたBuffer I や Buffer II もご利用いただけます（I とII の違いは MgCl2 の有無）。KCl バッファーにはPCR の特異性を高める作用があります。

Thermo-Start Taq DNA Polymerase は95℃ で15 分加熱することで活性型になる化学修飾タイプのDNA Polymerase です。一般的に抗体タイプのホットスタートTaq DNA Polymerase は60℃で酵素活性が現れますが、60℃付近ではプライマーの非特異的なアニーリングが完全に解消されず、またプライマーダイマーの存在も無視できません。一方、化学修飾タイプのTaq DNA Polymerase は95℃で活性化されるため、より特異性の高い増幅が得られます。

Thermo-Start Taq DNA Polymerase は95℃ で15 分加熱することで活性型になる化学修飾タイプのDNA Polymerase です。一般的に抗体タイプのホットスタートTaq DNA Polymerase は60℃で酵素活性が現れますが、60℃付近ではプライマーの非特異的なアニーリングが完全に解消されず、またプライマーダイマーの存在も無視できません。一方、化学修飾タイプのTaq DNA Polymerase は95℃で活性化されるため、より特異性の高い増幅が得られます。

Extensor Hi-Fidelity PCR Enzyme は最大で 20 kb までのDNA を増幅することができます。添付のBuffer 1は12kbまでの増幅に使用し、Buffer 2は12kb以上の断片を増やす場合にご使用ください。

いずれのpolymerase もターミナルトランスフェラーゼ活性（3' 末端付加活性）を持っているのでTA クローニングが可能です。Extensor Hi-Fidelity Enzyme mix には 3' → 5' のエキソヌクレアーゼ活性（校正活性）をもつ酵素が含まれていますが、PCR 産物の大部分はTaq DNA Polymerase により3' 末端にアデニンが付加された状態のため、そのまま TA クローニングに使用できます（Taq DNA Polymerase 単独で反応した場合と比べると若干効率は落ちます）。サブクローニングの際にはPCR 産物を一度精製して、このエキソヌクレアーゼ活性を完全に失活させてください（フェノール抽出によって酵素を完全に失活させることをおすすめします）

ReddyMix に含まれているLoading Dye は制限酵素消化やサブクローニングなどの実験には影響しません。ただし DNA シーケンシング実験ではDye を除去してください。

ご使用されるDNA テンプレートやプライマーの濃度によって使い分けてください。いずれのPCR Master Mix でも最終的なPCR 溶液（酵素、ヌクレオチド、バッファー）の組成は同じになるように調製します。 1.1X PCR Master Mix は 45 μl のPCR Master Mix に1 μl ずつのプライマーと3 μl のDNA テンプレートを混ぜて最終的に50 μl にしてください。2X PCR Master Mix では25 μl のPCR Master Mix にDNA テンプレートとプライマーを加えた後、最終的に 50 μl になるように分子生物学グレードの水でメスアップしてください。