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第3回 組織免疫化学 （固定からブロッキングまで）
テクニカルリソースでは、実験サポートをテーマにした記事をお送りしています。
第3回目のテーマは前号に引き続き「組織免疫化学」です。前回のメールマガジンでは、組織の固定法、切片の作製、内因性の酵素やビオチンのマスク、非特異的結合サイトのブロッキングについて説明しましたが、今回は抗体の標識やフラグメント化などを含めた抗体による抗原の可視化について説明します。
（執筆担当 サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）バイオサイエンス事業本部 萬代）
プロービングと可視化
酵素抗体法
酵素抗体法ではHRP(西洋わさびパーオキシダーゼ)やAP(アルカリホスファターゼ)を用います。基質を標識酵素と反応させて、発色性の反応産物を沈降させることで可視化します。染色した組織を安定に保管できること、光学顕微鏡により簡単に検出できることが特長です。
蛍光抗体法
蛍光抗体法では標識に蛍光色素を用います。最大の特長はマルチカラー検出が可能なことです。異なる励起・蛍光波長をもつ複数の蛍光色素を用いることで、組織や細胞内外で発現する複数の抗原を同時に検出することができ、抗原間の位置関係（同一細胞・異なる細胞での発現の確認など）を解析することが可能になります。
増感
染色感度は抗原に結合した酵素の分子数により決定されるため、ABC (Avidin-Biotin Complex)法（文献1-3）とよばれる手法はシグナル増幅に理想的です。アビジン-ビオチン複合体が組織への浸透には大きすぎる場合、酵素標識アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチン標識1次抗体を使用したLAB (labeled avidin-biotin)法とよばれる手法(文献4)が用いられることがあります。RYD(細胞接着因子との結合を示すRGDのミミック配列)を含まない非特異的結合が最小化されたNeutravidin（脱グリコシル化アビジン）に関しても酵素標識物をラインナップしています。
基質
Thermo Scientific Pierce製品には粉末状基質やキット製品など様々な製品がありますが、HRP用のMetal Enhanced DAB、AP用のNBT/BCIPが最も一般的な選択です。 最も感度が高い製品はMetal Enhaced DAB法によるPierce Peroxidase Detection Kit (製品コード36000)になります。本法では暗褐色～黒色の沈殿物を生じるコバルトとニッケルの沈着により、DAB法に比べ50倍以上の感度が得られるため、より鮮明な画像化が可能となります。
| 表 発色基質・色素一覧 | ||||
| 発色基質・発色色素 | 酵素 | 感度 | フォーマット | 製品コード |
| Metal Enhanced DAB | HRP | Highest | キット (2液) | 34065 |
| 1-Step TMB | HRP | High | 1液 | 34018 |
| 1-Step 4-CN | HRP | High | 1液 | 34012 |
| CN/DAB | HRP | High | キット (2液) | 34000 |
| DAB | HRP | Medium | 粉末 | 34001 |
| 1-Step NBT/BCIP | AP | High | 1液 | 34042 |
| 1-Step NBT/BCIP + Suppressor | AP | High | 1液 | 34070 |
| BCIP | AP | Medium | 粉末 | 34040 |
| NBT | AP | Medium | 粉末 | 34035 |
交叉反応とバックグランド
前回のメールマガジンでは、組織に内在する酵素やビオチンによるバックグランドに関して説明しましたが、組織に内在する血清蛋白質もバックグランドの原因となります。特にグロブリンに由来するバックグランドノイズがよく知られていることから、組織に内在するグロブリンに由来するバックグランドノイズの軽減に関して、以下ご説明します。
高度吸着抗体 （ImmunoPureシリーズ）
Thermo Scientific Pierceには、ビオチン、蛍光、酵素などで標識された、マウスやラビットなどの様々なホスト由来のポリクローナル抗体があります。ポリクローナル抗体と組織に内在する血清タンパク質との交差反応はバックグランド上昇の原因となることがあります。このような、血清タンパク質に対して交叉反応を示すポリクローナル抗体を、各種の血清タンパク質を固定化したカラムを通過させて、精製した抗原特異性の高い抗体を高度吸着抗体とよびます。 Thermo Scientific Pierceでは、ヒト、ウシ、ウマ、ウサギ、ブタなどの血清タンパク質との反応を最小限におさえた高度吸着抗体も、ご提供しております。
抗体の精製
市販されている抗体にはウシ血清アルブミン(BSA)などのキャリアタンパク質が安定剤として含まれていることがあり、これらのキャリアタンパク質がバックグランドノイズの原因となることがあります。
Melon Gel Spin Pufication Kit (製品コード45206, Thermo Scientific Pierce)では血清タンパク質はカラムに保持、精製抗体は中性pHの通過フラクション中に回収されます。本来の用途は血清からの抗体ワンステップ精製になりますが、市販抗体に含まれるキャリアタンパク質の除去にも使用できます。
抗体の標識
適当な市販の標識抗体がない場合には、抗体を自家標識して用いることもあります。蛍光標識では未反応の遊離蛍光色素によるバックグランドノイズの上昇はよく知られています。一般に蛍光色素は会合しやすく、透析やゲル濾過では除去が難しいことがあります。当社の蛍光標識キットでは独自の精製レジンを充填したスピンカラムによる、未反応の遊離蛍光色素の効果的な除去が可能です。
抗体フラグメントの利用
抗体フラグメントとは酵素消化により定常部位(Fc)を除去した抗体の断片(フラグメント)で、1価のFabやFabがヒンジ部位で結合した2価のF(ab’)2があります。
図1 Fabフラグメントの調製
図2 F(ab’)2フラグメントの調製
このような抗体フラグメントはIgG (Whole Molecule)に比べて、分子量が小さく組織への浸透が比較的よいのが特長です。また、抗Fabや抗F(ab’)2抗体を2次抗体として用いることで、内在するIgGとの反応(Fcへの結合)を抑え、バックグランドノイズを軽減できることもあります。
参考文献
- Hsu, S.M., et al. (1981). Am. J. Clin. Path. 75, 816.
- Hsu, S.M., et al. (1981). J. Histochem. Cytochem. 29, 577-580.
- Hsu, S.M., et al. (1981). Am. J. Clin. Path. 75, 734-738.
- Guesdon, J.L., et al. (1983). J. Histochem. Cytochem. 27, 1131.
