Thermo Scientific PCR関連製品
（Phusion Blood Direct PCR Kitを用いた血液サンプルからのダイレクトPCRおよびRFLP解析）

サーモフィッシャーサイエンティフィックでは、さまざまなテクノロジーを応用して、お客様のニーズに応えるThermo Scientific製品を開発しています。Phire Blood Direct PCR Kit はDNAの抽出・精製をせずに全血液から直接DNAを増幅するためのキットです。キットに含まれる Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase は、血液中の阻害物質に対する耐性が高く、PCR溶液中最大40 %の血液共存下でも酵素活性を示します。Phusion Blood Direct PCR Kit には、血液サンプルの保存方法や血液採取時に使用する抗凝固剤の種類にかかわらず、さまざまな動物種からダイレクトPCRを行なうための試薬が含まれています。今号では、全血液サンプルを直接用いたPCR-RFLP（PCR制限酵素断片長多型）解析を紹介します。方法としては、本キットを用いて全血液サンプルからゲノムDNAのフラグメントを直接PCR増幅し、精製せずにそのままPCR産物をSNP部位が特異的に認識される制限酵素で消化しました。そして、制限酵素消化後にアガロースゲル電気泳動によってDNAフラグメントを解析しました。

（執筆担当 サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）バイオサイエンス事業本部 広瀬）

材料と方法

  • ヒト全血液（抗血液凝固剤としてEDTAを含む）
  • Phusion Blood Direct PCR Kit
  • Hha I
  • 24-well Piko Thermal Cycler
  • UTW (ultra-thin walled) Piko PCR Plate
  • Arktik Isothermal Incubator
  • ヒトeukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3 (EIF2AK3) 遺伝子断片（429 bp）をターゲットとして増幅するプライマー対

Fig.01

図1 PCR溶液の調製法
＊詳細についてはPhusion Blood Direct PCR Kit manual をご参照ください。

Fig.02

図2 PCRのサイクル反応条件
＊条件設定などの詳細についてはPhusion Blood Direct PCR Kit manual をご参照ください。

結果と考察

PCR終了後に、反応サンプルを1000 x g、2分遠心し、上清を回収しました。上清10μLを直接Hha I 制限酵素(0.4 U/μL)とともに37℃にて1時間インキュベートし、サンプルをアガロースゲル電気泳動によって解析しました（図3）。アガロースゲル電気泳動のフラグメントのサイズによって、SNP部位のタイプを解析できました。

Fig.03

図3制限酵素によるSNP解析の模式図と結果
ヒトEIF2AK3遺伝子のSNP部位をカバーする429 bpのDNA断片を、複数個人の全血液から直接増幅しました(50 μL 反応系で5 % 全血液を使用、2ステップ40 サイクル反応)。 PCR産物は反応終了後に、SNP部位がGの場合にのみDNA断片を消化できるHha I制限酵素によって消化しました。レーンA・G・A/Gは、遺伝子型がそれぞれAおよびGのホモ、A/Gのヘテロを示しています。

注意事項

全血液サンプルから直接PCRを行うと、PCR産物とともに制限酵素消化の阻害物質である血液成分やPCR由来の試薬成分がサンプルに持ち込まれます。制限酵素の阻害物質存在下での活性は酵素によって異なるため、解析に用いる制限酵素によっては、酵素消化の反応条件を検討する必要があります。RFLP解析に使用する制限酵素のPhusion Blood PCR buffer中での活性が低い場合には、以下の方法を順に検討する必要があります。

  1. 消化前にPCR産物を希釈してください。PCR産物を水で1/3に希釈してください。また、PCR産物の収量が大きい場合には、制限酵素消化後の電気泳動に支障の無い範囲でできるだけ希釈してください。
  2. もし上記1のサンプル希釈で酵素活性が十分に得られない時には、PCR産物を精製する必要があります。
  3. さらに反応条件が厳格な制限酵素を用いる場合には、反応に用いる制限酵素の量や反応時間、反応バッファーを至適化する必要があります。

また、PCR終了後のサンプルを制限酵素で直接消化する場合、反応溶液中のPhusion Blood DNA Polymeraseは制限酵素によって消化されたDNA断片の付着末端を変えることがあります。そのためクローニングを目的に制限酵素消化する場合には、Phusion Blood DNA Polymeraseを失活させた上で、PCR産物を精製する必要があります。